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Engenharia Biomédica da Natureza (2023)Cite este artigo

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Um ensaio de placa - o método padrão-ouro para medir a concentração de vírions líticos competentes para replicação - requer coloração e geralmente mais de 48 horas de tempo de execução. Aqui mostramos que a imagem holográfica sem lente e o aprendizado profundo podem ser combinados para agilizar e automatizar o ensaio. O dispositivo de imagem compacto captura informações de fase sem rótulo a uma taxa de aproximadamente 0,32 gigapixels por hora por poço, cobre uma área de cerca de 30 × 30 mm2 e uma faixa dinâmica de concentração de vírus 10 vezes maior do que os ensaios padrão e quantifica os infectados. área e o número de unidades formadoras de placa. Para o vírus da estomatite vesicular, o ensaio automatizado de placas detectou os primeiros eventos de lise celular causados pela replicação viral já 5 horas após a incubação, e em menos de 20 horas detectou unidades formadoras de placas em taxas superiores a 90% a 100%. especificidade. Além disso, reduziu o tempo de incubação do vírus herpes simplex tipo 1 em cerca de 48 horas e o do vírus da encefalomiocardite em cerca de 20 horas. O ensaio sem manchas deve ser passível de utilização em investigação virológica, desenvolvimento de vacinas e diagnóstico clínico.

As infecções virais podem afectar milhões de pessoas em todo o mundo através de doenças infecciosas como a gripe, o vírus da imunodeficiência humana e o papilomavírus humano1. Os Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA estimaram que, desde 2010, o vírus influenza resultou em 16 a 53 milhões de doenças, 0,2 a 1 milhão de hospitalizações e 16.700 a 66.000 mortes somente nos Estados Unidos2,3. Além disso, a pandemia da COVID-19, que causou mais de 500 milhões de infecções e mais de 6 milhões de mortes em todo o mundo, trouxe um enorme fardo para a saúde pública e para o desenvolvimento socioeconómico de muitos países4. Para ajudar a enfrentar estes desafios de saúde global, é necessário desenvolver técnicas de quantificação de vírus precisas e de baixo custo para o diagnóstico clínico5, o desenvolvimento de vacinas6 e a produção de proteínas recombinantes7 ou de agentes antivirais8,9.

Desenvolvido em 1952, o ensaio de placas foi o primeiro método para quantificar as concentrações de vírus. Avançado por Renato Dulbecco, o ensaio permite que o número de unidades formadoras de placas (PFUs) seja determinado manualmente em uma determinada amostra contendo vírions líticos competentes para replicação10,11. Essas amostras são diluídas em série e alíquotas de cada diluição são adicionadas a uma placa de células cultivadas10. À medida que o vírus infecta as células adjacentes e se espalha, uma placa se forma gradualmente, que pode ser inspecionada visualmente por um especialista. Devido à sua capacidade única de fornecer a infectividade das amostras virais de maneira econômica, o ensaio de placas continua sendo o método padrão-ouro para quantificar as concentrações de vírus, apesar da existência de outros métodos12,13,14,15,16,17 ,18,19, como os ensaios de formação focal de imunofluorescência14, a reação em cadeia da polimerase16 e os ensaios baseados em imunoensaios enzimáticos19,20. No entanto, os ensaios de placas geralmente necessitam de um período de incubação de 2 a 14 dias (dependendo do tipo de vírus e das condições de cultura)21 para permitir que as placas se expandam para tamanhos visíveis e estão sujeitos a erros humanos durante o processo manual de contagem de placas22. Para melhorar os ensaios de placa tradicionais, vários métodos foram desenvolvidos23. Embora muitos sistemas tenham capacidades únicas para gerar imagens de culturas celulares em placas de poços, eles requerem marcadores de fluorescência22 ou placas de cultura especiais com microeletrodos de ouro24. Além disso, erros humanos de contagem ainda permanecem como um problema para estes métodos. Um ensaio de placas preciso, quantitativo, automatizado, rápido e econômico seria, portanto, vantajoso para pesquisas em virologia e aplicações clínicas relacionadas.

Alguns dos desenvolvimentos recentes em imagem de fase quantitativa (QPI), holografia e aprendizagem profunda oferecem uma oportunidade para atender a essa necessidade. QPI é uma técnica de imagem proeminente que permite a visualização e quantificação de amostras biológicas transparentes de maneira não invasiva e sem rótulos25,26. Além disso, a qualidade da imagem dos sistemas QPI pode ser melhorada utilizando redes neurais, melhorando, em particular, a recuperação de fase27, a redução de ruído28, a focagem automática29,30 e a resolução espacial31. Além disso, vários métodos de detecção e identificação de microrganismos baseados em aprendizagem profunda foram demonstrados usando QPI32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42.

90% PFU detection rate in <20 h, providing major time savings compared with the traditional plaque assays, which take ≥48 h. Furthermore, we show an average incubation time saving of ~48 h and ~20 h for HSV-1 and EMCV, respectively, achieving a PFU detection rate >90% with 100% specificity. A quantitative relationship was also developed between the incubated virus concentration and the virus-infected area on the cell monolayer. Without any extra sample-preparation steps, this deep-learning-enabled label-free PFU imaging and quantification device can be used with various plaque assays in virology and might help to expedite research in vaccine and drug development./p>95% coverage. During the virus infection, five wells were infected by 100 µl of the diluted VSV suspension (obtained by diluting a 6.6 × 108 PFU ml−1 VSV stock with a dilution factor of 2−1 × 10−6), and one well was left for negative control. Then, 2.5 ml of the overlay solution containing the total medium with 4% agarose was added to each well (see Methods for details, ‘Preparation of agarose overlay solution’). After the solidification of the overlay at room temperature, each sample was first placed into our imaging set-up for 20 h of incubation, performing time-lapse imaging to capture the spatiotemporal information of the sample. Then, the same sample was left in the incubator for an additional 28 h to let the PFUs grow to their optimal size for the traditional plaque assay (this is only used for comparison purposes). Finally, each sample was stained using crystal violet solution to serve as the ground truth to compare against our label-free method./p>90% at 20 h of incubation without having any false positives at any time point despite using no staining./p>1%), a faster PFU concentration readout can be provided at 12 h or 15 h. As the size of an average PFU on the well is physically larger at 15 h of incubation compared with 12 h, the slope of the red calibration curve in Fig. 6b is smaller than in Fig. 6a, as expected. For samples with even higher virus concentrations, the infected cell area percentage could reach >1% in ≤10 h of incubation (shown in Fig. 5c), providing the PFU concentration readout even earlier./p>70 °C during its operation, which could disturb the growth of the sample and vaporize the agarose layer, especially for regions that are near the sensor parking location between successive holographic scans. Hence, a cooling system was built using fans (QYN1225BMG-A2, Qirssyn). We also sealed the sides of the sample using parafilm (product number 13-374-16, Fisher Scientific) and opened four holes on the top cover to form a gentle ventilation system, which is an inexpensive and easy-to-implement solution to avoid sample drying./p>90% detection rate for VSV PFUs with 100% specificity in <20 h./p>11 TB) is available from the corresponding author on reasonable request./p>